本发明提供了一种DNA点突变定量检测方法，通过PNA探针两次对野生型模板的抑制，极大程度地抑制了野生型模板的扩增，解决了PNA钳制不完全的问题。同时，利用扩增引物Tm值差异和扩增时退火温度控制，使巢式PCR能在单管中进行，增强了扩增强度和扩增特异性。使拷贝数极低的临床样本的扩增成为了可能。最后，通过实时荧光的闭管检测，既实现了实时检测，又避免了样品的交叉污染，还实现了突变的定量。此外，该方法只需要普通实时荧光PCR仪器，且在2h内就能得到检测结果，试剂成本低，可实现对样品的快速、低成本检测。总之，该方法的成功建立，可为临床DNA点突变的检测提供一种高灵敏、高特异、简便快速、无污染和低成本的检测新方法。

一、临床常用突变检测方法及其局限性
基因突变是临床分子分型的常用指标。目前，临床检测基因突变的方法主要包括Sanger测序法、焦磷酸测序法、限制性片段长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）等，这些方法灵敏度很低，只能检测大于5%~20%的突变样本，难以满足临床样本的检测需求。实时荧光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）、扩增阻滞突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、高分辨熔解曲线（High-resolution Melting, HRM）法、突变富集PCR（Mutant Enrichment PCR，mePCR），低变性温度下的复合PCR扩增法（Coamplification at lower denaturation temperature PCR，ColdPCR）等方法灵敏度与Sanger测序法比较有较大提高，能够检测大于1%的突变。但这些方法难以实现对含量小于1%的低丰度血浆ctDNA样本的检测，且这些方法均只能对突变进行定性检测，难以实现定量检测。
如今，灵敏度>1%，且能实现对突变含量的方法主要有数字PCR（Digital-PCR，dPCR）和下一代测序（Next-generation Sequencing，NGs）。数字化PCR是基于单分子PCR方法来进行计数的一种核酸绝对定量方法，目前主要包括BEAMing技术、微滴式(droplet dPCR，ddPCR）和芯片式（chip dPCR，cdPCR）。该方法可检测低至0.01%的基因突变，且可实现突变的绝对定量，但数字化PCR分析样品通量很低，每块芯片上万个反应单元都是针对单一样本的分析，而荧光检测技术的局限性限制了多个芯片的同时检测。此外，数字化PCR昂贵的精密仪器和昂贵的试剂成本也是制约其广泛应用的一个重要原因；下一代测序技术是一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的测序技术，它能将样本中所有基因片段的序列检测出来，然后通过序列判断是否存在基因突变。但高通量测序需要昂贵的测序仪和昂贵的测序试剂，一次测序的成本在1000美元左右，严重限制了它在临床的推广应用。此外，如何解读二代测序得到的海量序列信息，是制约下一代测序技术应用于临床的瓶颈因素。总之，上述方法要么灵敏度低，要么无法定量，要么操作繁琐，成本高等问题。因此，亟需开发一种高灵敏、可定量、简便快速和低成本的基因突变检测新方法。
二、本发明技术原理与优势
本发明自主研发了一种名为双重PNA钳制反应介导的LNA-PNA钳制PCR技术（LNA-dPNA PCR clamp）平台。其原理是将单管巢式PCR、PNA钳制反应和定量PCR技术相融合，进而建立的一种新型ctDNA定量检测技术。由该技术原理可知，单管巢式PCR的融入，可增强PCR的扩增强度和扩增特异性，从而使拷贝数极低的临床样本ctDNA的扩增成为了可能；通过钳制探针两次对野生型模板的抑制，可极大程度地阻滞了野生型模板的扩增，解决了ctDNA样本中大量野生型DNA干扰ctDNA检测的问题；通过实时荧光的闭管检测既实现了实时监测，又避免了样品的交叉污染，还实现了突变的定量检测。此外，该方法只需要普通实时荧光PCR仪器，且在3小时内就能得到检测结果，试剂成本低，可实现对样品的快速、低成本检测。
三、本发明技术性能评价结果
在建立新型ctDNA检测技术后，我们对该技术的性能进行了评价（表1）。与ddPCR相比，本技术具有相当的平台通用性（可检测所有已知突变）、特异性（0.01% vs. 0.01%）和定量性能（R2=0.9568），但本技术具有更高的灵敏度（100拷贝/反应vs. 101拷贝/反应）和更宽的线性范围（7个数量级vs. 5个数量级），且本技术不需要昂贵的仪器，耗时更短（3.75 vs. 5.0），成本更低（140 vs. 392）；与ARMS PCR相比，本技术特异性更高（0.01% vs. 0.05%），且LNA-dPNA PCR clamp能定量，ARMS PCR不能定量。总之，本发明建立了一种宽线性（7个数量级），高灵敏度（100拷贝/反应），高特异性（0.01%），操作简单成本低（~3.75 h，140/样），闭管、实时、可定量的新型ctDNA检测技术平台。
表1. LNA-dPNA PCR clamp与ddPCR和ARMS-PCR性能比较

ARMS-PCR
ddPCR
LNA-dPNA PCR
clamp
灵敏度
101拷贝/反应
101拷贝/反应
100拷贝/
应
线性范围
101 ~ 107拷
/反应
101 ~ 105拷贝/反应
100 ~ 106拷贝/反应
特异性
0.05%
0.01%
0.01%
定量性能
无法定量或半定量
绝对定量
绝对定量
时间
~3.75 h
~5.0 h
~3.75 h
成本
900/样
98/test，392/样
35/test，140/样